Description du sujet

Présentation détaillée du projet doctoral:

La lamina nucléaire (ou matrice nucléaire) est un réseau de filaments qui tapisse la membrane interne (INM) de l’enveloppe nucléaire (Dobrzynska et al., 2016). Les composants de la lamina sont des protéines fibrillaires, nommées Lamines (Lamines A/C et Lamines B). L’expression de ces composants varie en fonction du développement et du type cellulaire. Ce réseau apporte une plateforme d’ancrage pour la chromatine et participe de ce fait à l’organisation tridimensionnelle du génome (pour revue (Gonzalez-Sandoval and Gasser, 2016). Les régions de chromatine qui se trouvent au contact de la lamina nucléaire ont été nommées LADs (Lamina Associated Domains). Ces domaines (subdivisions de la chromatine), au même titre que les TADs (Topologically Associated Domains), contiennent des milliers de gènes qui sont en général faiblement transcrits et présentent des marques épigénétiques inactives (Reddy et al., 2008).
Les LADs sont des structures dynamiques qui peuvent changer de position à l’intérieur même du noyau en fonction du type cellulaire et de la nécessité d’expression des gènes qu’ils contiennent (pour revue (van Steensel and Belmont, 2017)). Les mécanismes d’attachement de la chromatine à la lamina périnucléaire demeurent jusqu’à présent assez mal connus, ils pourraient impliquer des régions d’ADN (motifs), des nucléosomes ou d’autres mécanismes encore inconnus pour revue (Shevelyov and Ulianov, 2019)).
Il a été montré que des sous-compartiments de LADs pouvaient constituer une zone de transcription active, dans un contexte d’association avec la Lamine A (Gesson et al., 2016) ou avec la Lamine B1 (Pascual-Reguant et al., 2018). Une équipe Britannique a récemment proposé que la Lamine B1 pourrait être un répresseur de l’hypermutation somatique des gènes d’Immunoglobulines ainsi que des« dommages collatéraux » aux oncogènes (Klymenko et al., 2018). Nos modèles affectant l’hypermutation somatique des gènes d’Ig (KO pour les régions MARs des gènes d’Ig ou pour des facteurs liant ces régions tels que les facteurs des familles SATB, ARID3 et CUX) sont d’excellents outils pour tester ces hypothèses en lien avec la réparation infidèle (error-prone repair), spécifique des lymphocytes B. Des données que nous avons obtenues dans nos modèles posent la question de la régulation de l’attachement des gènes à la lamina., Ces données et hypothèses ouvrent un champ d’investigation sur la fonction de la lamina nucléaire au cours du développement de lymphomes. De plus, les enhancers des gènes d’Ig que nous savons impliqués dans la survenue des lymphomes sont également des points d’ancrage à la lamina dans les lymphocytes B.

Objectif et contexte:

Nous utiliserons plusieurs modèles KO à notre disposition au laboratoire et mettront au point de nouveaux modèles KI pour l’étude des régions d’intérêts pertinentes pour l’attachement à la matrice nucléaire. Nous proposons de approches méthodologiques par imagerie (microscopie) et à haut débit (ChIP-seq).

1/ Co-localisation des gènes d’Ig et oncogènes à la Lamina par Immuno FISH-3H: Nous utiliserons des cellules B (au repos et activées) triées de nos modèles (wt, MARsEμ KO, SATB1c KO, ARID3Ac KO) dans lesquelles nous réaliseront des marquages par FISH des loci IgH, Igk et de l’oncogène Bcl6 (ciblé par l’hypermutation/dommages collatéraux). Notre équipe possède l’expertise de ce type d’expérimentations pour avoir réalisé des études comparables, dans ces cellules B triées, de co-localisation de loci à l’hétérochromatine et aux foci H2AX (Ashi
et al., 2018; Bonaud et al., 2015; Le Noir et al., 2017), (https://www.unilim.fr/biscem/polemicroscopie/).
Ces analyses seront complétées par une analyse fine en microscopie de haute résolution (en collaboration avec l’équipe du Dr. Cyril Esnault, IGMM Montpellier, France)

2/ Détermination des points d’ancrage du génome des cellules B à la lamina (matrice périnucléaire) par ChIP-Seq
Sur le même matériel biologique, nous préparerons des échantillons de chromatine destinée à l’Immunoprécipitation par un anticorps anti LAMINE B1 selon un protocole décrit (Herranz et al., 2008; Pascual-Reguant et al., 2018). La chromatine immuno-précipitée sera soumise à un séquençage haut débit.

3/ Analyse bioinformatique croisée des données de ChIP-seq / ATAC-seq et RNA-seq permettant de définir les compartiments de la Lamina : c-LAD (LAD conventionnel, zone répressive) et e-LAD (LAD associé à l’euchromatine, zone de transcription active) selon la terminologie décrite dans (Pascual-Reguant et al., 2018).

4/ Etablissement de modèles cellulaires destinés à l’étude des relations structure/fonction des régions d’attachement à lamina et des facteurs nucléaires (MARs Binding proteins, protéines structurales de lamina, protéines associées à l’enveloppe nucléaire). Ce matériel cellulaire sera analysé par des méthodes similaires à celles décrites ci-dessus.

Résultats attendus:

Nos données préliminaires montrent que l’absence des région MARsEμ empêche la localisation périnucléaire et diminue les mutations des gènes d’Ig et des oncogènes du lignage B par un mécanisme qui fait appel au recrutement de facteurs de réparation infidèle (error-prone repair, Martin & al ; soumis) spécifiques aux gènes d’Immunoglobulines. Nous espérons montrer par ce projet que l’attachement à la Lamina est un évènement déterminant pour la survenue de ces mutations. Nous souhaitons vérifier que l’accessibilité des loci à la machinerie de réparation infidèle et par conséquent les mutation (légitimes ou illégitimes) est corrélée à une localisation dans un des compartiments de la Lamina : probablement le compartiment e-LAD (Pascual- Reguant et al., 2018).

Prise de fonction : 01/10/2022

Nature du financement : Contrat doctoral

Précisions sur le financement : Sous réserve de financement

Présentation établissement et labo d’accueil : UNIVERSITÉ DE LIMOGES – PÔLE RECHERCHE – COLLÈGE DOCTORAL

CRIBL, Equipe 2 B-NATION

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